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不同颜色代表对引物序列的评分

差异颜色代表对引物序列的评分

及时荧光定量PCR引物设计

及时荧光定量PCR作为尝试室最常用的尝试。研究基因在mRNA表达程度,以及验证基因敲除后下游靶基因变革环境等等。

首先,及时荧光定量PCR是一种在DNA扩增回响中,以荧光化学物质测每次聚合酶链式回响(PCR)轮回后产品总量的要领。通过内参可能外参法看待测样品中的特定DNA序罗列办定量阐明的要领。

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最常用的要领有SYBRGreenⅠTaqMan探针法。下面先容一下道理:

1.

SYBRGreenⅠ法:

在PCR回响体系中,插手过量SYBR荧光染料,SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后,发射荧光信号,而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号,从而担保荧光信号的增加与PCR产品的增加完全同步。

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差异颜色代表对引物序列的评分

2.

TaqMan探针法:

探针完整时,陈诉基团发射的荧光信号被淬灭基团接收;当PCR扩增时,Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解,使陈诉荧光基团和淬灭荧光基团疏散,从而荧光监测系统可吸收到荧光信号。因此他每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产品的形成完全同步。

差异颜色代表对引物序列的评分

在举办及时荧光定量PCR引物设计之前,各人都应该相识引物设计需要留意的一些细节与原则.

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下面先容两个在线设计及时荧光定量PCR引物的网站,不消安装软件,直接上网就可搞定。

Primerbank。

网址:https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/

1.首先进入网站主页,选择Keyword, 按照本身需求选择种属以及基因名称。

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2.点击 submit 后可以看到以下界面,网站会推荐多对引物,飞禽走兽,可以按照引物长度、Tm值选择。

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Primer3plus。

网址;

1. 在 PUBMED 得到基因序列后,在 primer3plus 主页上输入基因序列。

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2. 点击general setting, 配置引物扩增长度,一般可配置扩增长度偏大一些,然后按照推荐引物选取符合扩增长度。

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3. 点击pick primers后,首先会看到优选推荐的一对引物,同时在序列中看到引物地址位置。Primer3plus 网站中可以看到引物 Tm 值以及 GC含量。

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设计好引物之后,

最亏得NCBI的BLAST里检讨一下引物的特异性,再交给公司合成。

1. 进入 pubmed 主页,点击 BLAST 中 Nucleotide Blast。

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2. 选一条引物序列输入对话框,点击BLAST。

差异颜色代表对引物序列的评分

3. 网页打开后,会看到如下界面,差异颜色代表对引物序列的评分,一般会选择40分以上,即至少蓝色。继承下拉网页会看到序列具体信息,物种分类、基因名称以及序各位置。

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